如何初步確定樣品的凍干工藝——凍干工藝設(shè)置要點(diǎn)解析

1 引言

凍干工藝對(duì)樣品凍干具有重要的意義。一個(gè)好的凍干工藝不僅能保證樣品順利凍干，還能夠提升凍干效率。然而，在交流過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)許多朋友對(duì)凍干工藝設(shè)置了解并清楚，因此，在這篇文章中，我們將結(jié)合自己的經(jīng)驗(yàn)為大家介紹凍干工藝初步確定的一些要點(diǎn)。

2 凍干過(guò)程工藝確定要點(diǎn)

2.1 預(yù)凍階段

預(yù)凍階段的主要目的是使樣品固化。需要考慮的參數(shù)主要為預(yù)凍終點(diǎn)溫度和降溫速率。

預(yù)凍終點(diǎn)溫度需要根據(jù)樣品的物性參數(shù)確定，考慮到擱板與樣品之間的溫差，擱板溫度通常需要低于樣品凍結(jié)溫度10-20 ℃。溫差的大小需要考慮的因素包括：1）樣品高度，當(dāng)樣品溫度較高時(shí)，由于傳熱溫差的存在，靠近頂端樣品溫度偏高；2）環(huán)境溫度，外界環(huán)境輻射會(huì)改變樣品溫度；3）容器類型，不同容器條件下樣品和擱板之間的熱阻不同，使得樣品與容器之間溫差不同。4）樣品量，當(dāng)處理的樣品量較多時(shí)，不同樣品之間存在邊緣效應(yīng)，溫度存在區(qū)別，為保證所有樣品全部?jī)鼋Y(jié)，溫度需要適當(dāng)設(shè)置低一些。

降溫速率對(duì)樣品結(jié)構(gòu)存在影響，如較大的降溫速率條件下形成的冰晶比較小，而較小的降溫速率形成的冰晶較大。如果想要提升后續(xù)此外，較大的冰晶對(duì)生物樣品的活性也會(huì)存在影響，這點(diǎn)在凍干生物樣品時(shí)需要加以考慮。此外，設(shè)置降溫速率的時(shí)候也需要考慮設(shè)備自身性能，降溫速率設(shè)置過(guò)高時(shí)，設(shè)備可能無(wú)法實(shí)現(xiàn)，這也會(huì)影響凍干工藝應(yīng)用的范圍，因此，降溫速率不宜設(shè)置過(guò)高。

此外，在設(shè)置預(yù)凍階段參數(shù)時(shí)，可根據(jù)需要考慮引入退火過(guò)程和瞬時(shí)結(jié)晶過(guò)程。兩種過(guò)程介紹如下：

（1）退火過(guò)程

退火是指已經(jīng)凍結(jié)的樣品升溫至退火溫度（通常介于濕基質(zhì)玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度和共晶溫度之間），并在此溫度保持一段時(shí)間，然后再將樣品重新冷卻至更低的溫度，使其固化。退火過(guò)程可以提升樣品均勻性，減小樣品內(nèi)應(yīng)力，提升樣品塌陷溫度等。退火過(guò)程的關(guān)鍵在于退火溫度的選取，過(guò)高的退火溫度會(huì)使得樣品融化，而過(guò)低的退火溫度則達(dá)不到退火的效果。

圖1 不同預(yù)凍方式下得到的膠原蛋白微觀形貌

（2）瞬時(shí)結(jié)晶技術(shù)

樣品的成核過(guò)程具有一定的隨機(jī)性，這主要是因?yàn)樵跇悠返某珊诉^(guò)程中，需要一定的熱力學(xué)漲落來(lái)克服成核勢(shì)壘。成核溫度的不一致性會(huì)導(dǎo)致樣品的批間差異性較大。為解決這一問(wèn)題，目前發(fā)展出了多種技術(shù)，如冰霧技術(shù)，真空誘導(dǎo)成核，超聲波等，來(lái)實(shí)現(xiàn)冰晶的瞬時(shí)結(jié)晶2.2 升華干燥階段

升華干燥階段主要調(diào)控的參數(shù)為腔體內(nèi)壓力（真空度）和擱板溫度。主要目的在于保證樣品安全的前提下提升干燥過(guò)程速率?？紤]到在干燥階段升華界面冰晶升華帶走熱量，使得升華界面溫度較低。當(dāng)升華界面溫度高于塌陷溫度時(shí)，即樣品較低溫度都超過(guò)了塌陷溫度值，樣品出現(xiàn)塌陷的風(fēng)險(xiǎn)極大。因此，可以采用升華界面溫度作為判斷樣品是否會(huì)發(fā)生塌陷的判斷依據(jù)。

在另一方面，升華界面溫度和飽和蒸氣壓存在對(duì)應(yīng)關(guān)系，通過(guò)冰晶飽和蒸氣壓公式可以將升華界面溫度與壓力聯(lián)系起來(lái)，常用的簡(jiǎn)化關(guān)系式如下所示：

從上式也可以看出，升華界面溫度越高，對(duì)應(yīng)的飽和蒸氣壓也就越高。當(dāng)壓力達(dá)到塌陷溫度對(duì)應(yīng)飽和蒸汽壓時(shí)，即可認(rèn)為樣品溫度超過(guò)了塌陷溫度。可以假設(shè)這么一種情況，如果干燥腔內(nèi)壓強(qiáng)與塌陷溫度對(duì)應(yīng)壓強(qiáng)相同，樣品內(nèi)的冰晶如果要升華，則升華界面的壓力需要不低于腔體內(nèi)壓強(qiáng)。根據(jù)上面的公式，則樣品溫度超過(guò)塌陷溫度，干燥過(guò)程就失敗了。因此，干燥腔內(nèi)壓力必須低于塌陷溫度對(duì)應(yīng)的飽和蒸氣壓P_tc；

目前，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值，一般將腔體內(nèi)真空度P大小設(shè)置為P_tc的1/3到1/2。而樣品溫度T_p則可以結(jié)合上述公式與P的大小確定。確定好樣品溫度T_p后即可確定擱板溫度，在干燥階段，擱板溫度T_s=T_p+15-(輻射升高溫度值)；其中，輻射升高溫度值與環(huán)境溫度有關(guān)系，環(huán)境溫度高的時(shí)候，輻射升高溫度值需要設(shè)置高一些。而在環(huán)境溫度低時(shí)，輻射升高溫度值需要適當(dāng)設(shè)置低一些。

2.3 解吸干燥階段

與升華干燥階段類似，解吸干燥階段需要考慮的參數(shù)也是真空度和擱板溫度，但解吸干燥階段參數(shù)的設(shè)置與升華干燥階段參數(shù)存在一定區(qū)別。由于樣品的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度與樣品中的含水量有關(guān)，當(dāng)樣品完成升華干燥時(shí)，其玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度也隨之升高，因此，可以在解吸干燥階段采用較高的溫度，而不用擔(dān)心樣品融化。

同時(shí)，由于樣品中的自由水在升華干燥階段都被除去，剩下的結(jié)合水先后經(jīng)歷樣品內(nèi)擴(kuò)散、解吸等階段，較低的艙壓能夠形成高壓差增加結(jié)合水解吸速率，提升解吸驅(qū)動(dòng)力。因此，在解吸干燥階段一般采用較高的溫度和降低的壓強(qiáng)值，其中，擱板溫度以不超過(guò)樣品的干基玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度為準(zhǔn)。

3 總結(jié)

在這篇文章中，我們給大家介紹了凍干工藝確定的要點(diǎn)以及凍干參數(shù)設(shè)置背后的原因，希望能對(duì)大家有所幫助。但是需要指出的是，上述只是對(duì)凍干工藝的初步確定，一個(gè)“好"的凍干工藝還有許多工作要做，比如，干燥時(shí)間的設(shè)置就需要借助終點(diǎn)判斷功能；不同樣品凍干的目的側(cè)重點(diǎn)不同，所需要采用的凍干工藝也有所區(qū)別。